建立了一种超高效液相色谱-质谱分析运动饮料中叶酸的方法。样品前处理用体积分数10%乙醇沉淀提取后，采用Waters Atalantis T色谱柱(2.1mm×150mm,3μm)分离，以0.1%甲酸-10.0 %甲醇为流动相的梯度洗脱模式下，叶酸组分在1.0～200.0 ng/mL内线性良好，相关系数为0.999 5，检出限为0.4 μg/kg，定量限为1.5 μg/kg，加标回收率为91.0%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为2.1%～3.7%。该方法具有前处理简单、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于运动饮料中较宽浓度范围的叶酸含量的分析。
运动饮料是依据人体运动体消耗大量能量后，急需补充能量而配制成的一种富含多种营养元素的饮料[1-2]。运动饮料中营养物质主要有糖类，电解质，维生素，氨基酸等成分，都是人体所需的各种营养元素。其中叶酸是一种重要的水溶性维生素，是人体正常的物质代不可缺少的化合物，在人体生长各个过程中发挥着重要的作用[3-5]。在我国标准GB 15266—2009《运动饮料》中[6]，仅针对VC、硫胺、核黄素这3种维生素作出了限量要求，叶酸含量未作出限量要求，但是针对特殊人群的饮料，有必要了解其叶酸的含量，以便保障人们科学、定量地摄入此种维生素。
目前，国家标准GB/T 5009.211—2008《食品中叶酸的测定》和GB 5413.16—2010《婴幼儿配方食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)测定》中对食品和婴儿食品和乳制品中叶酸的测定采样微生物法[7-8]，此方法比较繁琐，重复性差。其他一些文献中检测叶酸含量多采用紫外分光光度法、荧光法、液相色谱法、气质联用和高效液相色谱质谱联用等方法[9-15]。本研究利用质谱的多反应监测模式的选择性和性，结合运动饮料中成分相对简单，可简化提取过程的特点，建立一种超高效液相色谱-质谱法测定运动饮料中叶酸的方法，灵敏度高，线性范围宽，极大地提高了检测效率，可为运动饮品中叶酸含量的测定提供技术支持和参考。
超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪，美国Waters公司UPLC/XEVO TQ-S；标准品叶酸、13C5-叶酸放射性同位素内标，美国 Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国 Fisher Scientific 公司。
采用针泵连续进样的方式，在正离子模式(ESI+)下，先对目标物进行母离子全扫描，然后对其子离子进行全扫描，分别选定定性离子和定量离子，并对喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描停滞时间、去簇电压及碰撞电压等参数进行优化。
叶酸标准储备溶液：称取5.0 mg的叶酸标准品，用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液溶解并定容至50 mL，避光保存。
叶酸-13C5标准储备溶液：称取5.0 mg的叶酸-13C5标准品，用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液溶解并定容至50 mL，避光保存。
准确吸取上述叶酸标准溶液，稀释成浓度为1.0、10.0、20.0、100.0、200.0 ng/mL的系列混合标准溶液，现配现用。
运动饮料若直接上样测定叶酸含量，样品中的干扰成分太多会影响测定，故要对运动饮料中的一些干扰基质进行沉淀净化。本实验结合叶酸成分的化学性质以及样品为运动饮料的特性，比较了甲醇、10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4种提取溶剂对目标物的提取效果。
以已知目标成分含量的运动饮料为基质，加入叶酸标准溶液，选择优化后的前处理条件和仪器条件，上机检测，计算回收率。
食品中叶酸的检测比较常用的色谱柱有C18柱和T3柱[16-18]。因此，本实验比较了Waters BEH C18(2.1 mm×150 mm，3 μm)和Waters Atalantis T3(2.1 mm×150mm，3 μm)这2款不同的色谱柱。结果发现叶酸是以离子形态存在于溶液中，在C18柱上的保留能力较弱，目标物的总离子流图的分析效果不理想；但是在T3柱分析柱上由于其特殊键合力，能与叶酸形成氢键的结合力强弱不同，在分离时更具有优势，目标物的分离效果更好，所以本实验选择T3柱进行叶酸的分析色谱柱。
在选择T3柱作为叶酸的分析色谱柱的前提下，参考相关文献[19-23]，本实验对甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸以及10%甲醇-0.1%甲酸等3种流动相进行比较，来考察对叶酸分析结果的影响。结果发现10%甲醇-0.1%甲酸作为流动相，叶酸的分离效果最好，目标峰的分离度高，峰形尖锐，基线
质谱条件的优化采用针泵连续进样的方式，在正离子模式(ESI+)下，对浓度为100 ng/mL的叶酸的标准溶液进行母离子全扫描，确定其离子，优化各母离子的锥孔电压。再在上述母离子的基础上，对其子离子进行全扫描，选择2组丰度最高的离子，较高的作为定量离子，次之的为定性离子，并对喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描停滞时间、去簇电压及碰撞电压等参数进行优化。
标准曲线的制作为了验证叶酸成分在优化好的仪器条件中的线 ng/mL的系列标准溶液上机进行检测。实验结果表明，叶酸成分在1.0～200.0 ng/mL内均具有良好的线)，并得到目标组分的检出限为0.4 μg/kg，定量限为1.5 μg/kg，结果见表3。2
在对叶酸目标物提取的过程中，目标成分易被以及样品中沉淀所吸附，所以在前处理过程中既要考虑要好目标成分也要避免目标物被沉淀所吸附。本实验参考相关文献[24-28]，结合叶酸物质是水溶性物质的特性以及样品为运动饮料的特性，比较了甲醇、体积分数10%甲醇、10%乙醇、10%乙腈等4种提取溶剂对目标物的提取效果。表3
结果如图3所示，4种提取溶剂中，10%乙腈为提取溶剂时，运动饮料中的叶酸回收率最高，其次为10%乙醇、10%甲醇；甲醇为提取溶剂时，虽然样品中的基质沉淀效果明显，但是叶酸的回收率不高，可能是混合液对运动饮料中的叶酸有作用；其中10%乙醇提取率虽不及10%乙腈的提取效果好，但是考虑到乙腈的毒性比乙醇大，以及成本问题，所以本实验还是选择10%乙醇作为运动饮料叶酸成分的提取溶剂。
在上述优化后的前处理条件仪器条件下，利用已测定叶酸含量的运动饮料进行加标回收率实验，在分别添加50、100、200 μg/100g等3个梯度浓度的标准溶液，每个浓度平行测定5次，测定结果见表4。表4方法的回收率及相对标准偏差
Recoveriesandrelativestandarddeviations(RSD)ofthemethod(n=5)由表4可见，叶酸的加标回收率为91.0%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为2.1%～3.7%，表明本实验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。本研究在市场上随机抽取了10个批次的运动饮料，依据以上所建立的方法测定。测定结果显示，所测定的运动饮料中都含有一定量的叶酸，但是所测品种之间叶酸的含量差别较大，10个批次的运动饮料的叶酸含量为46.4～260.9 μg/100g。3 结论
本文建立了一种超高效液相色谱-质谱检测运动饮料中叶酸含量的分析方法。结果表明，通过优化后的质谱条件，在MRM扫描模式下，叶酸组分能在5 min实现快速分离检测。样品经过10%乙醇提取后，可有效去除运动饮料中的复杂基质，鬼节出生的人可实现对目标物质的净化，能准确快速有效地检测运动饮料中的叶酸成分，对市场上随机收取的10个批次的运动饮料进行检测，其含量为46.4～260.9 μg/100g。本方法具有快速、简单、准确、灵敏等特点，可对较宽浓度范围内的叶酸含量进行分析，有助于提高食品检测实验室的分析效率，降低成本，为运动饮料中叶酸的测定提供营养价值参考。
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